全世界超過10%的人口患有慢性腎?。?/span>CKD）。糖尿病和高血壓是導致終末期腎病（ESRD）發(fā)展的主要原因，常與腎小球有關。高血壓被認為會特異性地損害足細胞，足細胞是腎小球中一種終末分化的上皮細胞類型，具有較大的細胞體、延伸突起和足突（FP），貼附于腎小球基底膜（GBM）表面。為了防止腎小球高血壓引起的足細胞脫離和損傷，了解負責的機械傳感器是必不可少的。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的足細胞具有機械敏感性，并且機械應力和流動誘導的剪切應力會改變它們的肌動蛋白細胞骨架以及基因表達。然而，負責肌動蛋白重組的機械傳感器仍然未知。

斑聯(lián)蛋白（Zyxin）是一種重要的黏著斑（FA）和肌動蛋白相關蛋白，已被描述為在細胞對機械力的反應中起重要作用。Zyxin是一種鋅結合磷蛋白，有一個N-末端的富含脯氨酸結構域和三個在其C-末端的一半LIM結構域。據(jù)報道，Zyxin的N末端結合輔肌動蛋白α-actinin、細胞骨架效應蛋白Ena/VASP及LIM和SH3結構域蛋白1（LASP-1）和拉伸應力敏感蛋白p130Cas。特別是，Zyxin的LIM結構域?qū)Ρ┞队趩屋S拉伸的細胞中的肌動蛋白結合和應力纖維定位至關重要。這可能足以在細胞遷移過程中產(chǎn)生力誘導的Zyxin積累。

在體內(nèi)，Zyxin被描述為防止高血壓引起的心功能障礙以及發(fā)揮機械傳感器的功能。最近，德國格賴夫斯瓦爾德大學醫(yī)學院解剖和細胞生物學系、海德堡大學心血管生理學系及漢堡-埃彭多夫大學醫(yī)學中心的研究團隊調(diào)查了Zyxin在機械拉伸的足細胞（腎小球高血壓模型）中的作用，描述了Zyxin在體外機械拉伸期間對有絲分裂后足細胞的粘附，以及體內(nèi)維持腎臟過濾是必不可少的。研究成果發(fā)表在Communications Biology期刊題為“Zyxin is important for the stability and function of podocytes, especially during mechanical stretch”。

首先，研究Zyxin在培養(yǎng)的小鼠足細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)Zyxin與黏著斑蛋白以及肌動蛋白纖維共定位。

為了確定機械拉伸是否調(diào)節(jié)Zyxin的表達，將足細胞暴露于拉伸應力3天（0.5Hz，5%伸長率），通過免疫熒光染色和qRT-PCR分析Zyxin在拉伸（STR）和未拉伸（US）足細胞中的表達。結果發(fā)現(xiàn)，由于機械拉伸，Zyx mRNA水平有輕微但顯著的增加。此外，足細胞肌動蛋白細胞骨架由于機械拉伸從橫向應力纖維重組為徑向應力纖維，而且機械拉伸還誘導了沿肌動蛋白絲以及肌動蛋白富集中心（ARC）的Zyxin定位增加。

然后研究了Zyxin在暴露于機械應力3天的足細胞中的作用，生成Zyxin敲除足細胞系（Zyx-KO），并在相同條件下拉伸Zyx-KO和對照足細胞（Ctrl）（圖1 a、b），發(fā)現(xiàn)機械拉伸后，Zyx-KO足細胞的細胞丟失比對照組更高（圖1 d）。然而，機械拉伸對拉伸誘導的F-肌動蛋白細胞骨架重組和剩余Zyx-KO足細胞的ARC形成沒有影響（圖1 c）。這表明，Zyxin敲除足細胞在機械拉伸后細胞粘附降低，細胞丟失增加。

為了研究機械應力下細胞粘附降低是否是由于黏著斑蛋白的丟失，分析確定了Zyx-KO足細胞中典型黏著斑（FA）蛋白talin、vinculin和paxillin的表達水平。與對照組相比，Zyx-KO足細胞的vinculin蛋白和mRNA水平顯著降低，但talin和paxillin的表達不受Zyxin敲除的顯著影響（圖1 e、f）。此外，Zyxin的丟失顯著影響了FAs的大小（圖1 g），vinculin的單個FA面積大小顯著減小。talin的FA大小保持不變，paxillin陽性黏著斑甚至擴大。此外，機械拉伸條件下，vinculin的平均FA大小的降低更為明顯（圖1 h）。

為了找出其他受Zyxin調(diào)控的蛋白，對Ctrls和Zyx-KO足細胞克隆進行了蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，Zyx-KO足細胞中檢測到71種顯著上調(diào)蛋白和105種下調(diào)蛋白（圖1 i），圖1 k顯示了前25種上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)。值得注意的是，Zyx-KO足細胞中GO簇被強烈下調(diào)，這與細胞粘附或肌動蛋白絲組織有關（圖1 j）。

圖1 zyxin KO足細胞的鑒定及蛋白質(zhì)組學分析。

接下來，研究了Zyxin對zyxin-結合蛋白VASP表達的影響，發(fā)現(xiàn)Zyx-KO足細胞VASP的蛋白水平較對照組顯著降低，但其他肌動蛋白相關蛋白，如filamin A、α-actinin-1，的表達不受Zyxin丟失的影響。此外，Zyx-KO足細胞中，VASP向肌動蛋白絲的募集似乎被破壞，這表明VASP以Zyxin依賴性方式被募集到肌動蛋白應力纖維中。蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)進一步顯示，Zyx-KO足細胞中GO簇“肌動蛋白絲組織”的顯著調(diào)控，特別是，SIRPA（酪氨酸蛋白磷酸酶非受體型底物1）和IQGAP2（Ras GTPase激活樣蛋白）的蛋白和mRNA水平顯著升高。

蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)表明，細胞外基質(zhì)（ECM）蛋白在Zyx-KO足細胞中顯著下調(diào)（圖2 a）。因此，分析了特異性ECM蛋白的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)Nid2、Thbs1和Postn的mRNA水平顯著降低（圖2 b）。通過免疫染色和Western blot分析Zyxin的丟失是否也會影響纖連蛋白的表達（圖2 c、d），發(fā)現(xiàn)與對照相比，Zyx-KO足細胞中纖連蛋白的蛋白水平顯著降低，特異性纖連蛋白受體整合素α5的表達也顯著降低，但整合素β1的蛋白質(zhì)水平?jīng)]有變化（圖2 d）。

由于Zyxin缺乏會顯著降低ECM蛋白的表達，因此實驗還研究了Zyxin在細胞鋪展中的作用，將Ctrl和Zyx-KO足細胞的大小進行量化（圖2 e），發(fā)現(xiàn)與對照相比，Zyx-KO足細胞在粘附的初始階段細胞鋪展和細胞大小都有所減少（圖2 e）。此外，Zyx-KO足細胞的遷移速度和距離顯著增加（圖2 f）。

根據(jù)Zyx-KO足細胞中fascin-1蛋白的顯著降低，研究人員推測絲狀偽足的發(fā)育是由于Zyxin的丟失而改變的，因此分析了Zyx-KO和Ctrl足細胞的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)除Cdc42外，許多參與絲狀偽足形成的必需蛋白在Zyx-KO足細胞中顯著下調(diào)，且其中絲狀偽足的數(shù)量和平均長度均減少。

圖2 Zyx-KO足細胞顯示細胞外基質(zhì)蛋白的表達降低。

為了弄清楚Zyxin是否在DN患者中也受到調(diào)控，實驗分析了其在患者腎小球中的mRNA表達，并與微小病變腎病（MCD）患者和健康者的mRNA水平進行了比較。結果觀察到，與對照組織相比，DN患者的ZYX mRNA顯著增加，MCD患者的Zyxin表達沒有顯著變化（圖3 b），對人類疾病數(shù)據(jù)的分析進一步證實（圖3 c）。此外，在患有DN合并高血壓的患者腎小球足突中，Zyxin和突觸足蛋白（Synaptopodin）的共定位很強（圖3 a）。雖然健康者和MCD患者的Zyxin僅在足細胞中略有表達，但在DN患者中高表達（圖3 a）。此外，在DN患者中，Zyxin表達特異性增加足細胞（圖3 d）。此外，數(shù)據(jù)分析表明，在局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）患者中，Zyxin表達與蛋白尿顯著相關，但與MCD患者和（圖3 g）和血壓（圖3 h）不相關。

此外，在Zyxin敲除后通過PAS染色分析了腎小球，在6個月時檢測到系膜的擴張。腎小球硬化的評估證實了Zyx KO小鼠的腎小球損傷。進一步確定足突形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)在Zyx KO小鼠中，與對照小鼠相比，狹縫隔膜密度顯著降低。通過電子顯微鏡確認腎小球的形態(tài)變化，觀察到Zyx KO腎小球中的部分足細胞足突消失、假性囊腫、系膜細胞擴張和腎小球基底膜增厚。此外，與野生型小鼠相比，雄性Zyx KO小鼠的蛋白尿顯著增加。

圖3 Zyxin在糖尿病腎病和高血壓小鼠中上調(diào)

這項研究強調(diào)了Zyxin對足細胞的重要作用。Zyxin的體外丟失降低了vinculin、VASP和基質(zhì)蛋白的表達；在小鼠中，Zyxin的敲除導致蛋白尿和足細胞足突的消失。綜上所述，該研究表明Zyxin是一種重要的蛋白質(zhì)，對體外和體內(nèi)足細胞的穩(wěn)定性和功能至關重要，尤其是在機械拉伸下。

參考文獻：Kliewe F, Siegerist F, Hammer E, Al-Hasani J, Amling TRJ, Hollemann JZE, Schindler M, Drenic V, Simm S, Amann K, Daniel C, Lindenmeyer M, Hecker M, Völker U, Endlich N. Zyxin is important for the stability and function of podocytes, especially during mechanical stretch. Commun Biol. 2024 Apr 11;7(1):446. doi: 10.1038/s42003-024-06125-5. PMID: 38605154; PMCID: PMC11009394.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38605154/

圖片來源：所有圖片均來源于參考文獻

本文旨在分享、交流生物領域研究進展，關注“Naturethink”公眾號，了解更多相關內(nèi)容。

點擊了解：牽張應變細胞培養(yǎng)儀